FASILITAS DAN BAHAN DI LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

YANCE TASUMOLANG

10 310 831

UNIVERSITAS NEGERI MANADO

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

JURUSAN BIOLOGI

MATERI 2

FASILITAS DAN BAHAN DI LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

Pertumbuhan eksplan dalam kultur jaringan diusahakan dalam lingkungan yang aseptik dan terkendali. Laboratorium yang efektif merupakan salah satu unsur penting yang ikut menentukan keberhasilan pekerjaan, baik untuk penelitian, mau-pun produksi. Laboratorium sebaiknya dibangun di daerah yang udaranya bersih, tidak banyak debu dan polutan. Bangunan laboratorium kultur jaringan sebaiknya mempunyai pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa sehingga tiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainnya, tetapi mudah saling berhubungan dan mudah dicapai.

Pembagian ruangan laboratorium kultur jaringan berdasarkan kegiatan-kegiatannya adalah sebagai berikut :

1. Ruang persiapan/preparasi
2. Ruang transfer/tanam
3. Ruang kultur/inkubasi
4. Ruang stok/media jadi
5. Ruang timbang/bahan kimia

6.      Ruang pencucian

7.      Ruang persiapan media, sterilisasi dan penyimpanan

1.      Ruang Persiapan

Ruang ini dipergunakan untuk mempersiapkan media kultur dan bahan tanaman yang akan dipergunakan, sebagai tempat mencuci alat-alat laboratorium, dan tempat untuk menyimpan alat-alat gelas. Sesuai dengan fungsinya, maka di-ruangan ini terdiri dari :

1. Hot plate dengan magnetic stirer
2. Oven
3. Pengukur pH, dapat berupa pH meter, atau kertas pH indikator
4. Autoklaf
5. Kompor gas
6. Tempat cuci
7. Labu takar, gelas piala, erlenmeyer, pengaduk gelas, spatula, petridish, pipet, botol kultur, pisau scapel.

Di dalam ruang persiapan media harus tersedia tempat untuk penyimpanan bahan-bahan kimia, gelas kultur dan penutupnya, dan peralatan gelas yang diperlukan untuk pembuatan media. Meja yang kokoh atau ”bench” untuk penyimpanan ”hot plate magnetic stirrer”, pH meter, timbangan, dan dispenser harus tersedia. Peralatan lain yang biasanya ada di ruang persiapan dan pembuatan media antara lain alat vaccum, distiling unit, bunsen, refrigerator (kulkas) dan freezer untuk penyimpanan larutan stok dan bahan kimia, mikrowave, kompor gas, oven dan autoclave untuk sterilisasi mdia, peralatan gelas dan peralatan lain. Didalam pembuatan media kultur, bahan-bahan kimia yang digunakan harus yang bertaraf analitik dan penimbangannya harus baik dan benar. Agar lebih akurat, dalam pembuatan media harus dilakukan tahap demi tahap dan bahan-bahan yang digunakan harus di ”checklist”. Air yang digunakan dalam pembuatan media harus berkualitas tinggi yang mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi. Air ledeng atau sumur tidak digunakan untuk pembuatan media karena mengandung kation-kation (amonium, kalsium, besi, magnesium natrium, dll.), anion-anion (bikarbonat, klorida, flourida, fosfat, dll.), mikroorganisme (algae, jamur, bakteri), gas-gas (oksigen, CO2, nitrogen) dan bahan-bahan lain (minyak, bahan organik dll.). Air yang digunakan dalam kultur jaringan harus mempunyai standar type II (minimum) yaitu bebas pirogen, gas, dan bahan organik dan mempunyai konduktivitas elektrik kurang dari 1.0 µmho/cm. gambar Metoda yang paling umum untuk pemurnian air standar type II adalah dengan deionosasi yang diikuti dengan satu atau dua destilasi gelas. Deionisasi menghilangkan dari bahan yang bersifat ionik dan proses destilasi menghilangkan molekul-molekul organik, mikroorganisme dan pirogen. Metode-metode lain yang dapat digunakan untuk mendapatkan air murni type II adalah

(1)  penyaringan dengan cara absorpsi, dengan menggunakan karbon aktif untuk menghilangkan kontaminan organik dan bebas klorine;

(2)  penyaringan dengan membran, yang menghilangkan bahan-bahan partikulat dan kontaminasi oleh bakteri; dan

(3) reverse osmosis, yang menghilangkan sekitar 99% bakteri, bahan organik dan bahan partikulat.

2.      Ruang Transfer/Tanam

Ruang transfer merupakan ruang di mana pekerjaan aseptik dilakukan. Dalam ruangan ini dilakukan kegiatan isolasi tanaman, sterilisasi dan penanaman eksplan dalam media. Ruangan ini sedapat mungkin bebas dari debu dan hewan kecil, serta terpisah dan tersekat dengan ruangan lain. Penggunaan AC sangat dianjurkan dalam ruangan ini. Ruang transfer dilengkapi peralatan sebagai berikut :

1. Laminar air flow cabinet, bisa juga enkas
2. Alat-alat diseksi; pisau bedah/scapel, pinset, spatula, dan gunting.
3. Hand sprayer yang berisi alkohol 70 %
4. Lampu bunsen

3.      Ruang Kultur/Inkubasi

Merupakan ruang yang paling besar dibanding dengan ruangan yang lain. Ruangan ini harus dijaga kebersihannya dan sedapat mungkin dihindari terlalu banyak keluar masuknya orang-orang yang tidak berkepentingan. Ruangan ini berisi rak-rak kultur yang berfungsi untuk menampung botol-botol kultur yang berisi tanaman. Rak ini juga dilengkapi dengan lampu-lampu sebagai sumber cahaya bagi tanaman kultur. Selain rak kultur, ruang kultur juga harus dilengkapi dengan AC, pengukur suhu dan kelembapan, serta timer yang digunakan untuk menghidup-kan dan mematikan lampu secara otomatis.

Lampu yang digunakan bisa berupa lampu TL dengan daya 15 watt atau 40 watt, tergantung panjang rak yang dibuat. Jarak antar rak 30 – 35 cm. Sebaiknya travo pada lampu TL dipasang terpisah dari box, (lebih baik kalau dipasang di luar ruang kultur), karena dapat membakar tanaman kultur dan membuat suhu ruang menjadi panas.

Selain lampu TL, lampu SL juga dapat dipakai. Pemakaian lampu ini dapat meng-hemat biaya listrik, juga lebih terang. Tinggi rak yang dibuat antara 50 – 60 cm. Dalam satu bidang rak dapat memakai 2 atau 3 lampu SL daya 5 – 10 watt tergantung ukuran panjang rak. Panjang penyinaran/lama penyinaran yang dibutuhkan oleh tiap tanaman berbeda-beda. Berapa lama penyinaran harus diberikan, tergantung pada jenis tanaman dan respon yang diinginkan. Ada kultur yang membutuhkan waktu pe-nyinaran yang terus menerus, ada yang 14 – 16 jam/hari, ada yang 10 – 12 jam/hari. Rata-rata waktu penyinaran yang efektif adalah 12 – 16 jam/hari.

Gambar penampang rak kultur bila memakai lampu SL

Gambar penampang rak kultur bila memakai lampu TL

4.      Ruang stok/media jadi

Ruangan ini berfungsi sebagai ruang untuk menyimpan media tanam yang sudah di autoklaf. Ruang stok sebaiknya dingin dan gelap, serta kebersihannya harus dijaga. Media tanam akan diinkubasi pada ruang ini selama 3 hari sebelum digunakan. Hal ini untuk mengetahui kondisi media tanam apakah steril atau ter-kontaminasi jamur/bakteri. Apabila media terkontaminasi, sebaiknya segera dikeluar-kan dan diautoklaf selama 1 jam pada tekanan 0.14 Mpa.

5.      Ruang Timbang/Bahan Kimia

Ruang ini berisi stok bahan-bahan kimia, timbangan analitik, magnetik stirer dan lemari es. Semua kegiatan penimbangan bahan kimia dan pembuatan larutan stok dilakukan di ruangan ini.

Berikut skema laboratorium kultur jaringan yang mempunyai 5 ruang sesuai dengan tahapan dan fungsinya masing-masing : Sedangkan pada laboratorium sederhana, ruang tanam, ruang kultur dan ruang stok media dapat digabung menjadi satu ruangan. Sedangkan ruang preparasi /per-siapan dapat digabung dengan ruang bahan kimia (seperti dalam gambar di bawah). Dari 2 ruangan ini, ruang tanam + kultur harus memakai AC. Untuk daerah yang bersuhu dingin, tanpa memakai AC tidak ada masalah.

6.      Ruang Pencucian 

Ruang pencucian harus mempunyai bak cuci, meja kerja yang terbuat dari bahan yang tahan terhadap asam dan basa, rak pengering dan mempunyai saluran untuk air demineralisasi atau destilasi, ruang untuk tempat oven pengering, alat/mesin pencuci dan pengering, serta rak atau lemari penyimpanan alat.

Alat dan Bahan untuk Kultur Jaringan

a.      Alat untuk pembuatan media kultur jaringan

1. Gelas becker/piala, untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air aquades dalam pembuatan media. Ukuran gelas piala bervariasi, 100ml, 300ml, 1000ml, 2000ml.
2. Pipet, untuk mengambil cairan.
3. Timbangan, untuk menimbang bahan kimia yang diperlukan dalam pembuatan media kultur.
4. Spatula, untuk mengambil bahan kimia yang diperlukan dalam pembuatan media kultur.
5. Indicator pH/ lakmus, untuk mengukur pH media ketika membuat media.
6. Sendok kaca, untuk mengaduk media saat persiapan dan saat pemanasan.
7. Panci, uempat memasak media.
8. Kompor, untuk pemanas saat memasak media.
9. Autoklaf, untuk mensterilkan semua peralatan dan media kultur yang dipakai dalam kegiatan kultur jaringan.
10. Botol kultur, tempat untuk mengkulturkan atau menanam eksplan.
11. Plastik dan karet tahan panas, untuk penutup pada botol kultur dan sebagai pengikat plastik dengan botol kultur.

Ø  Alat Penyiapan Eksplan (Inisiasi)
1. Botol kultur, tempat untuk mengkulturkan atau menanam eksplan.
2. Scalpel, untuk pemotongan eksplan
3. Gunting, untuk memotong eksplan

Ø  Alat Penanaman (Inokulasi)
1. Laminar air flow/enkas, untuk menanam eksplan ke dalam botol dalam kondisi steril atau melakukan sub kultur yang dilengkapi dengan blower dan lampu UV.
2. Pinset, untuk mengambil eksplan.
3. Spatula, untuk mengambil eksplan berupa biji/plb anggrek.
4. Petridish, tempat untuk memotong-motong eksplan yang akan di tanam dalam botol kultur.
5. Bunsen, untuk menggarang/membakar alat-alat kultur, seperti alat-alat diseksi ketika melakukan penanaman sehingga peralatan tersebut tetap steril.

Ø  Alat Inkubasi
1. Rak kultur, tempat untuk menyimpan botol-botol berisi eksplan hasil inokulasi dan mengoptimalkan pemanfaatan ruangan yang ada.
2. Air conditioner (AC), untuk menjaga suhu ruangan agar tetap stabil sesuai dengan kondisi suhu untuk kultur jaringan.
3. Lampu, untuk memberikan penerangan dan cahaya bagi pertumbuhan tanaman.
4. Timer listrik, untuk mengatur waktu penyinaran pada tanaman kultur.
5. Termometer suhu ruangan, untuk mengetahui suhu ruangan

Ø  Alat Aklimatisasi
1. Ember, untuk tempat plantlet yang telah dikeluarkan dari botol yang akan dicuci.
2. Gelas becker/piala, tempat perendaman plantlet dengan fungisida dan bakterisida.
3. Pinset, untuk mengeluarkan plantlet dari botol kultur.
4. Timbangan, untuk menimbang fungisida dan bakterisida.
5. Pengaduk kaca, untuk mengaduk larutan fungisida dan bakterisida.
6. Pot try, tempat menanam plantlet.
7. Kertas koran, sebagai alas untuk mengeringkan tanaman yang sudah di rendam.

b.      Persiapan Bahan

Ø  Bahan untuk Pembuatan Media
• Media MS jadi, bahan kimia untuk pembuatan media, hyponex
• Gula
• Agar
• Air

Ø  Bahan untuk Sterilisasi Eksplan
• Eksplan
• Air
• Fungisida
• Bakterisida
• HgCl2
• Klorox/pemutih pakaian
• Alkohol

Ø  Bahan untuk Penanaman (Inokulasi)
• Alkohol
• Air steril
• Betadin
• Eksplan

Ø  Bahan untuk Aklimatisasi
• Tanaman
• Air
• Fungisida
• Bakterisida
• Media (mos, pakis, arang, sterofom)