10
310 831
UNIVERSITAS
NEGERI MANADO
FAKULTAS
MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
MATERI 4
TEKNIK STERILISASI
Sterilisasi
adalah segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang
steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril.
Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang
disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang
melakukan kultur jaringan juga harus steril. Peralatan yang kami gunakan yaitu
petridish yang berfungsi untuk media pemotongan hasilnya steril karena dalam
mensterilisasi sesuai petunjuk. Alat yang kedua yaitu botol kultur yang
berfungsi untuk menaruh penanaman eksplan hasilnya juga steril karena sangat
hati-hati dalam melakukan sterilisasi. Peralatan yang ketiga yaitu Erlenmeyer yang
berfungsi untuk pencucian,hasilnya juga steril karena dalam melakukan
pensterilan dilakukan dengan sungguh-sungguh dan menjaga kondisi lingkungan
tetap steril. Peralatan yang keempat yaitu scalpel yang berfungsi untuk
memotong eksplan,hasil alat tersebut juga steril karena praktikan dalam
melakukan sterilisasi selalu dalam keadaan steril dan berhati-hati. Peralatan
yang ke lima yaitu pinset yang berfungsi untuk mengambil eksplan,hasil alatnya
juga steril karena dalam melakukan pensterilan dilakukan sesuai petunjuk dan
keadaan lingkungan serta praktikan steril sehingga tidak ada bakteri yang
masuk. Peralatan yang ke enam yaitu aluminium foil yang berfungsi untuk
membungkus botol kultur,hasilnya alat tersebut juga steril karena praktikan
menggunakan dengan hati-hati dan cermat.
Salah satu faktor penentu keberhasilan
kultur jaringan adalah tahap sterilisasi. Kegiatan sterilisasi ini meliputi
pada:
- Sterilisasi pada lingkungan kerja.
- Sterilisasi pada alat-alat dan media tanam.
- Sterilisasi bahan tanaman (eksplan).
Kegiatan sterilisasi ini sangat penting untuk dilakukan,
karena kontaminasi pada kultur jaringan dapat berasal dari:
- Eksplan, baik kontaminasi eksternal maupun internal.
- Organisme kecil yang masuk ke dalam media, seperti semut.
- Botol kultur atau alat-alat yang kurang steril.
- Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor.
- Kecerobohan dalam bekerja.
Dalam sterilisasi bahan tanaman, hal yang penting yang
harus mendapat perhatian adalah; bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah
sama-sama benda hidup. Kontaminan harus dihilangkan tanpa mematikan sel
tanaman.
Beberapa jenis
bahan disenfektan yang dapat digunakan untuk sterilisasi bahan tanaman :
|
No
|
Bahan
|
Konsentrasi
|
Lama perendaman
|
|
1
|
Kalsium hipoklorit
|
1 – 10 %
|
5 – 30 menit
|
|
2
|
Natrium hipoklorit
|
1 – 2 %
|
7 – 15 menit
|
|
3
|
Hidrogen peroksida
|
3 – 10 %
|
5 – 15 menit
|
|
4
|
Perak nitrat
|
1 %
|
5 – 30 menit
|
|
5
|
Merkuri klorit (HgCl2)
|
0.1 – 0.2 %
|
10 – 20 menit
|
|
6
|
Bethadine
|
2.5 – 10 %
|
5 – 10 menit
|
|
7
|
Fungisida
|
2 g/l
|
20 – 30 menit
|
|
8
|
Antibiotik
|
50 – 100 mg/l
|
½ - 1 jam
|
|
9
|
Alkohol
|
70 %
|
1 – 10 menit
|
|
10
|
Bayclin/sunclin
|
5 – 30 %
|
5 – 25 menit
|
Bahan-bahan sterilisasi ini pada umumnya bersifat
toxic/racun terhadap jaringan tanaman. Pembilasan yang berkali-kali sesudah
perendaman eksplan di dalam larutan bahan streilisasi, sangat diperlukan untuk
menghilangkan sisa-sisa bahan aktif yang masih menempel dipermukaan bahan
tanaman.
Dalam sterilisasi, kadang-kadang digunakan dua atau lebih
bahan sterilisasi. Misalnya; perendaman dalam alkohol dulu, kemudian dalam
bayclin, setelah itu bilas dengan air steril. Dapat juga perendaman di mulai
dengan larutan fungisida atau antibiotik, kemudian baru HgCl2 dan
dibilas dengan air steril. Prosedur mana yang efektif, harus ditentukan melalui
percobaan pendahuluan.
Sterilisasi bahan tanaman dimulai dengan pencucian dan
pembuangan bagian-bagian yang kotor dan mati di bawah pancuran air bersih.
Pencucian dapat dilakukan dengan penyikatan menggunakan detergent halus.
Kadang-kadang bahan yang sudah bersih dibiarkan dibawah pancuran air selama 30
menit. Hal ini dilakukan untuk memecah koloni kontaminan yang masih menempel
dipermukaan agar koloni tersebut lebih peka terhadap bahan-bahan sterilisasi.
Juga untuk mengurangi dan menghilangkan senyawa fenol, terutama pada tanaman
yang kandungan fenoliknya tinggi.
Bahan yang sudah bersih dikecilkan sampai ukuran
tertentu. Ukuran ini harus lebih besar dari ukuran eksplan yang direncanakan.
Bahan kemudian direndam dalam larutan fungisida/antibiotik. Setelah waktu
perendaman tercapai, bahan dicuci bersih dan ditiriskan, kemudian bawa masuk ke
dalam laminar. Di dalam laminar eksplan direndam dalam alkohol 70 % selama 1 –
2 menit, dan dibilas dengan air steril sekali. Kemudian rendam eksplan dalam
larutan bayclin 20 % + tween-20 2 tetes selama 10 menit. Tween-20 ini berfungsi
sebagai perekat. Setelah waktu pe-rendaman tercapai, eksplan dibilas dengan air
steril 3 – 5 kali selama 5 menit untuk tiap-tiap pembilasan dan letakkan di
dalam petridish yang dialasi tissue steril. Bila semua prosedur sudah
dilakukan, berarti bahan tanaman sudah siap di tanam pada media kultur.
Prosedur sterilisasi dapat dimodifikasi sesuai dengan
kebutuhan, seperti :
- Fungisida – alkohol – bayclin – bayclin – aquades steril
- Alkohol – bayclin – bayclin – aquades steril
- HgCl2 – alkohol – aquades steril
- Fungisida – bayclin – bayclin – bayclin – aquades steril
- dll
Sterilisasi alat – alat
gelas
Botol kultur
biasanya kecil potensinya sebagai penyebab kontaminasi, karena selalu
diautoklaf dengan media. Alat gelas lain dapat disterilisasi dengan
beberapa cara, misalnya ekspos ke radiasi UV, penggunaan larutan desinfestasi
atau lebih mudah dengan mengautoklaf atu dengan pemanasan dalam oven pada 180oC
selama minimal 3 jam. Alat – alat plastik seperti polypropylene atau
polycarbonate mesti disterilisasi dengan autoklaf karena mereka tidak tahan
panas kering pada 180oC. Wadah plastic dapat digunakan berulangkali;
karena mereka tahan diautoklaf berulangkali tapi akhirnya menjadi sedikit
mengkerut (brittle).
Untuk
sterilisasi panas kering (dalam oven), peralatan seperti scalpel, gunting dan
forsep, petri dish, beaker dll, dapat dibungkus dengan kertas atau aluminium
foil terlebih dahulu sebelum diautoklaf. Kertas yang diautoklaf kemudian
dikeringkann dengan cara meletakkan pada oven dengan suhu 60 – 70oC atau di dalam
laminar air flow cabinet sebelum digunakan.
Teknik Sterilisasi –
manipulasi bahan tanaman
Sumber utama
kontaminan adalah spora jamur dan bakteri yang membentuk bagian alami dari
atmosfer. Dapat diasumsikan bahwa agen kontaminasi ada dimana – mana, misalnya
pakaian, kulti, rambut dan nafas si operator, jaringan tanaman, peralatan,
bagian luar wadah kultur, permukaan tempat kerja, dan banyak lagi. Udara steril
di dalam laminar air flow cabinet memungkinkan kita untuk dengan mudah membuka
wadah kultur dan bekerja secara steril.
Peralatan dapat
disterilisasi dengan mencelupkan pada alcohol 70 – 80% yang diikuti dengan
pembakaran (flaming) menggunakan Bunsen burner atau lampu spiritus.
Bleach dapat juga digunakan sebagai alternatif untuk mensterilisasi peralatan
dengan alcohol. Larutan klorin encer (0.1 – 0.25% klorin) dapat
digunakan. Peralatan harus stainless steel, karena bahan lain akan
berkarat dengan cepat jika direndam dalam bleach.
Secara ringkas
langkah berikut mesti dilakukan jika melakukan kegiatan kultur jaringan:
- Semprot atau usap baigan dalam laminar flow cabinet dengan 70% etil atau isopropyl alcohol sebelum menghidupkan cabinet. Alcohol 70% penting dinguankan, absolute alcohol (95%) tidak membunuh mikroba)
- Hidupkan cabinet. Jika anda menggunakan lampu UV pastikan anda sudah mematikannya sebelum meletakkan bahan tanaman di dalam cabinet.
- Semprot semua wadah dan bahan dengan ethanol 70% sebelum meletakkannya dalam cabinet.
- Cuci tangan dan lengan dengan sabun dan air dan usap dengan 70% ethanol sebelum mengambil tanaman. Penting dicatat bahwa ethanol memiliki efek residual; karenanya sebaiknya menggunakan Hexifoam (desinfektan untuk kulit).
- Jika menggunakan api, berhati-hatilah
- Atur ruang kerja dalam cabinet sehingga tidak banyak gerakan tangan menyilang di dalam cabinet.
- Jika bahan tanaman jatuh ke permukaan cabinet, anggap terkontaminasi dan buang
- Setelah selesai mentransfer kultur, matikan cabinet, semprot atau usap dengan 70% ethanol dan tutup cabinet.
Sterilisasi
dapat dilakukan dengan cara:
a. Sterilisasi dengan pembakaran
Alat-alat yang terbuat dari logam dapat disterilkan
dengan cara memanaskan atau membakar di atas lampu spirtus.
b. Sterilisasi dengan udara panas/kering
Alat-alat dari gelas seperti cawan petri, erlenmeyer,
tabung piala, botol eksplan, tabung reaksi dan sebagainya dapat disterilkan
dengan udara panas (oven) pada suhu 130 – 160o C selama 1 – 2 jam.
Alat alat ditata tidak terlalu rapat agar sirkulasi udara antar tumpukan alat
dapat berjalan lancar, sehingga semua alat dapat disterilkan dan dapat dengan
mudah dijaga kesterilannya saat dikeluarkan dari alat sterilisasi.
c. Sterilisasi dengan uap panas (basah)
Bahan atau alat dapat disterilkan dengan uap panas atau
secara basah pada uap panas biasa atau uap panas dengan tekanan tinggi, secara
terus menerus (kontinyu) atau secara terputus putus (diskontinyu), khususnya
medium pada suhu atau tekanan yang rendah. Untuk sterilisasi dengan cara ini
sering kali menggunakan otoklaf. Sterilisasi medium biasanya dilakukan pada suhu
121oC dengan tekanan 1 atm selama 15-30 menit, namun untuk medium
yang tidak mudah rusak dapat dilakukan pada suhu atau tekanan yang sedikit
lebih tinggi.
d. Sterilisasi dengan bahan kimia
Bahan kimia tertentu sering digunakan untuk sterilisasi
alat maupun bahan. Etanol 70% sering digunakan untuk sterilisasi permukaan pada
alat yang sering dikombinasi dengan pembakaran pada api. NOCl (natrium
hipoklorit) dan formalin juga sering digunakan untuk sterilisasi permukaan atau
disinfestasi permukaan atau disinfeksi permukaan.
e. Sterilisasi
lingkungan kerja
Lingkungan kerja untuk teknik kultur jaringan dapat dibagi
atas lingkungan umum dan lingkungan spesifik. Lingkungan umum adalah ruangan
transfer secara keseluruhan, sedangkan lingkungan spesifik adalah lingkungan
didalam laminar air flow cabinet dimana proses penanaman eksplan dan prosedur
lain seperti isolasi protoplasma dilakukan.
f. Sterilisasi
alat-alat dan media
Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah:
pinset, gunting, gagang scalpel, petridisk, botol-botol kosong, jarum suntik
untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel.
Media dan aquades juga disterilkan dalam autoclave.Untuk
aquades sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya elemeyer 250 ml dengan
isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Untuk media kultur yang
tidak mengandung bahan-bahan yang heat-labile, sterilisasi dilakukan
dengan autoclave pada suhu 1210C.
g. Sterilisasi bahan tanaman
Pada setiap jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan yang
berasal dari dalam jaringan tanaman, terutama bakteri.Bakteri-bakteri ini
sampai sekarang belum diidentifikasi.Kontaminan internal ini sangat sulit
diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah.Pada bahan
tanaman yang mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotik
atau fungisida yang sistemik.
Setiap
bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminasi yang berbeda tergantung dari :
a. Jenis
tanaman
b.
Bagian tanaman yang diperlukan
c.
Morfologi permukaan
d.
Lingkungan tumbuhnya
e.
Umur tanaman
f. Kondisi
tanaman
g.
Musim waktu mengambil
Sumber
kontaminasi dapat barasal dari :
1. Eksplan,
baik kontaminasi eksternal maupun internal
2. Organisme
kecil yang masuk ke dalam media. Dengan keadaan di Indonesia, yang pling sering
menyebabkan kontaminasi adalah semut.
3.
Botol kultur atau alat-alat yang kurang steril.
4.
Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara)
5.
Kecerobohan dalam pelaksanaan.
Seperti yang dijelaskan diatas, alat-alat yang perlu
disterilkan sebelum penanaman adalah : pinset, gunting, gagang scalpel, kertas
saring, petri dish, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan
pipet untuk memindahkan suspensi sel. Alat-alat dan kertas saring dibungkus
rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya
dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan ke dalam autoclave. Alumunium
foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke
dalam bungkusan. Suhu yang digunakan untuk sterilisasi adalah 1210 C
pada tekanan 17,5 psi (pounds per squareinch) selama 1 jam. Perhitungan
waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.
Alat-alat yang dipakai ketika penanaman harus dalam keadaan
steril.Alat-alat logam dan dapat disterilisasikan dalam autoclave. Alat tanam
seperti : pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau
dengan pemanasan, namun pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila
dipanaskan dalam suhu tinggi, oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara
sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit (Syahmi edi,
2007)
Dalam
sterilisasi alat, ada 2 macam Sterilisasi, yaitu :
1. Sterilisasi luar :
o
Sterilisasi luar merupakan sterilisasi alat-alat dengan menggunakan
deterjen/sabun dan air yang mengalir. Botol-botol kultur dicuci dengan cara
menggosok seluruh bagian botol (dalam dan luar) dengan menggunakan
deterjen/sabun.
o
Kemudian membilas botol-botol kultur tersebut dengan air yang mengalir sampai
air mengenai seluruh bagian botol dan membersihkan bekas-bekas deterjen/sabun.
o
Setelah dibilas dengan air mengalir, botol diletakkan ditempat yang sudah
disemprot dengan alkohol
2.
Sterilisasi dalam :
o
Sterilisasi dalam dilakukan dengan cara memasukkan botol-botol kultur ke dalam
autoclave. Alat-alat yang disterilisasi dengan autoclave adalah alat yang
berupa logam dan gelas.
o
Botol-botol kultur dan alat-alat tanam yang dibungkus dengan kertas dimasukkan
kedalam autoclave selama 1 jam. Suhu yang digunakan untuk sterilisasi adalah
1210C karena pada suhu tinggi tersebut mikroba akan mati pada
tekanan 17,5 psi (pounds per squareinch).
o
Perhitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.
Pada prinsipnya, peralatan yang digunakan dalam praktikum
ini haruslah steril. Karena peralatan yang tidak steril akan dapat menjadi
sumber kontaminan sehingga menggagalkan percobaan kultur jaringan yang
dilakukan.
Selain peralatan seperti : pinset, gunting, gagang scalpel,
petridisk, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet
untuk memindahkan suspensi sel, media dan aquades yang digunakan juga harus
disterilisasi. Namun terkadang hal itu saja tidaklah cukup karena sterilisitas
dari praktikan juga sangat mempengaruhi. Jadi apabila praktikan akan melakukan
percobaan, maka praktikan harus membersihkan dirinya terlebih dahulu.
Diantaranya praktikan dapat melakukan hal-hal sebagai berikut : mandi, mencuci
tangan dan kaki dengan sabun, mengganti pakaian yang bersih atau pakaian khusus
praktik, dan usaha-usaha lain yang dapat menghindarkan kontaminasi.
SUMBER
:
